间充质干细胞MSCs或可成为增强版DC疫苗大规模生产用于临床
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前言
树突状细胞（DC）对激活细胞毒性T淋巴细胞（CTL）至关重要，CTL是抗肿瘤免疫反应的重要组成部分。尽管树突状细胞有良好的临床安全性和免疫原性，但由于其在正确处理抗原方面效率低下，且体内持久性有限，限制了其在癌症疫苗方面的应用。此外，来源于癌症患者的DC前体细胞的数量和功能受损使其不足以用于自体癌症免疫治疗。因此，急需一种够绕过上述屏障的抗原呈递细胞（APC）。
有研究者工程化间充质基质细胞（MSCs），并随后作为癌症疫苗，选择MSCs是因其在低水平IFNγ时已知的抗原呈递能力。为了在MSC中更有效的抗原呈递，研究人员利用逆转录病毒载体引入了编码IPr的基因，IPr是一种特殊的蛋白酶体，具有肽切割特性，IPr亚基之间使用2A肽连接，能够产生稳定的免疫原性p-MHC复合物；研究人员猜测这会将MSC转化为抗原呈递细胞。由此产生的MSC-IPr表达MHC-I，CD80和IL-12，而不表达PD-L1，IL-4或IL-10。它们的趋化因子表达谱与传统骨髓衍生的DC相似。与抗原呈递、免疫应答和代谢相关的过程被上调，而与蛋白质折叠、氨基酸周转、ER 应激和 pH 降低相关的途径被下调。
在RNA-seq检测到的755个差异表达基因中（control MSC与MSC IPr），14.43%（109个基因）与抗原处理和呈递有关。然而，与DC相比，在MSC IPr中，Tapbp、Tap1、Tap2、Calr和Nlrc5的表达水平较低（图2）。
MSC IPr中的抗原呈递途径不同于DC
MSC IPr的抗原交叉呈递可能依赖于涉及细胞外抗原捕获内化的其他途径。为了验证这一假设，对荧光标记OVA的摄取时间进行了评估。令人惊讶的是，与BM衍生的DC相比，MSC IPr表现出OVA内化的适度增加（图3A）。我们推测，内化OVA的细胞内途径可能起作用。因此，我们通过靶向抗原摄取呈递途径的各种药物抑制剂来分析对交叉呈递的影响。图3B和3C所示的结果表明，MSC IPr的抗原捕获是由胞饮作用介导的，因为在二甲基阿米洛利（DMA）、氧化苯丙氨酸（PhenO）或细胞松弛素（Cyto）D处理后，抗原交叉呈递和摄取都受到损害。使用萤光黄CH（LY）进一步证实了这一观察结果，其通过大胞饮作用进入细胞（图3D和3E）。使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）和wortmanin观察到T细胞活化的边际抑制作用（图3B）。然而，这种减少很可能是由于抗原摄取减少，而不是自噬抑制（图3C）。另一方面，氯喹（CQ,早期内体酸化抑制剂）治疗显著增强了抗原交叉呈递（图3B），尽管它对抗原摄取有负面影响（图3C），而布雷菲尔丁A（BFA；内质网至高尔基体转运抑制剂）、诺科达唑（NocoD；晚期内体转运抑制剂，外毒素A（ExoA；Sec61通道抑制剂）对MSC IPr的交叉呈递能力没有影响（图3B）。与此形成鲜明对比的是，添加Eeyarestain I（EER1），一种p97相关去泛素化过程的抑制剂，完全消除了抗原交叉呈递（图3B），而不影响抗原摄取（图3C）。抗原交叉呈递不受靶向晚期内体转运、液泡酸化或内质网高尔基体囊泡转运的抑制剂的影响，这表明MSC IPr可能不完全依赖于“胞质或液泡途径”，而是遵循一种可能涉及早期内化的途径。CQ的使用证实了这一观点，因为阻断MSC IPr早期内体的pH酸化进一步增强了T细胞活化，而不同于DC的边际效应（图3F），支持了MSC IPr中的抗原途径不同于DC的观点。当使用DQ OVA（一种在蛋白水解降解时发出荧光信号的自猝灭OVA缀合物）在DC和MSC IPr中随着时间的推移进一步评估抗原处理时，在用CQ处理的MSC IPr中检测到延长/延迟的OVA处理（图3G）。与这些结果一致，代表pH降低途径的热图揭示了MSC IPr中各种V型蛋白ATP酶的总体下调（图3H），这通过pHrodo-Green葡聚糖信号的降低进一步得到了证实，反映了内体/液泡pH的增加（图3I和3J）。这些数据有力地表明了，MSC IPr中的抗原途径和稳定性不同于DC，并最终保留了内化的抗原，从而产生强烈的T细胞反应。
接下来，他们研究发现用IPr改造MSCs会诱导代谢重编程，尽管编码Glut1和Glut4的基因的表达保持不变，但这些葡萄糖转运蛋白在细胞表面上调，这表明其降解减少或循环增加。此外，在MSC IPr中，耗氧率也增加，活化/功能性线粒体的百分比较高，AMPK及其两个靶基因高度活化。线粒体功能和AMPK都是抗原交叉呈递功能和T细胞活化所必需的，这表明IPr的表达与有利于氧化磷酸化的代谢重编程有关。
在评估ATP代谢途径时，研究人员发现MSC IPr吸收了更多的葡萄糖，并含有更高水平的糖酵解中间体G-6-P和丙酮酸。过量的丙酮酸并没有完全转化为乳酸，而是被TCA循环利用，增加了线粒体的活性。除了产生ATP外，线粒体活性的增加还增加了超氧化物阴离子的产生和HIF-1α的水平，降低了线粒体活性产生的各种活性氧（ROS）对T细胞活化产生的负面影响，这表明TCA循环中间体和抗原交叉呈递之间存在关联（图5）。
对MSC-IPr作为APC更深入的研究法发现，其可以作为癌症疫苗的用途。用OVA脉冲的MSC IPr在小鼠中具有良好的耐受性，诱导T细胞反应（通过产生IFNγ和TNFα来评价），并保护小鼠免受皮下或全身表达OVA的E.G7肿瘤的影响；而DC疫苗只对皮下肿瘤有保护作用。MSC IPr疫苗在对表达非OVA的EL4肿瘤存在的情况下也能保护免受表达OVA的E.G7的影响，这表明即使在生长中的肿瘤释放免疫抑制因子存在的情况中也有疗效。此外，用肿瘤细胞裂解物脉冲的MSC IPr诱导了对EL4淋巴瘤70%的保护和对B16F10黑色素瘤80%的保护；相似的DC疫苗分别诱导了20%和40%的保护作用。
在治疗环境中，OVA脉冲的MSC IPr疫苗仅延迟了小鼠荷瘤中表达OVA的E.G7淋巴瘤肿瘤的肿瘤生长，而肿瘤裂解物脉冲的MSC IP疫苗导致了30%的存活率。激动剂4-1BB、抗LAG3、抗CTLA-4或抗PD-1的加入分别增加了存活率，值得关注的是，MSC IPr疫苗加上PD-1抗体达到80%的存活率，同时加入激动剂4-1BB和PD-1抗体，获得了100%的存活率，8/10只小鼠显示出完全的肿瘤消除。发现T细胞向肿瘤部位的聚集对抗肿瘤疗效至关重要。使用B16F10黑色素瘤的肿瘤裂解物脉冲疫苗也观察到类似的结果。
在研究MSC IPr在体内迁移时发现，虽然它们比各种对照持续的时间更长，但MSC IPr未能迁移到肿瘤或淋巴器官。进一步的研究表明，MSC IPr疫苗诱导的抗肿瘤免疫依赖于MSC IPr在MHC-I上的抗原呈递和内源性DC对抗原的交叉呈递，内源性DC可能从MSC IPr中吸收抗原并将其运送到T细胞激活位点，研究人员发现，同种异体MSC IPr疫苗在预植入A20淋巴瘤肿瘤的小鼠中诱导了60%的存活率，而同种异体DC诱导了0%的存活率。抗PD-1的加入使MSC IPr疫苗的存活率提高到100%，DC疫苗的生存率提高到40%。这些结果表明了使用同种异体MSC IPr具有“现货型”疫苗的潜力。
最后，研究人员发现，在EL4肿瘤裂解物脉冲后，MSC IPr和DC之间的肽长度、结合亲和力和肽基序相似。然而，两种细胞类型之间的抗原库显著不同，MSC IPr提供的肽数量是DC的四倍。
总体而言，工程化MSC IPr诱导代谢重编程，从而支持促炎表型和抗原呈递特性。与DC相比，MSC IPr疫苗提供了一组独特的抗原，并诱导了更有效的抗肿瘤免疫，可与检查点阻断剂和激动剂4-1BB联合增强。MSC-IPr疫苗，包括那些由异基因细胞开发的疫苗，可以作为一种独特的癌症疫苗策略，克服与DC疫苗相关的一些挑战。
END